CRISPR-Cas系统是目前应用最广泛的基因编辑工具，其起源是来自于细菌和古细菌中针对噬菌体，病毒或其他外源入侵核酸的一种获得性免疫系统。其最大亮点是其可编程的指引RNA（guide RNA）介导效应器Cas蛋白（如Cas9, Cas12, Cas12, Cascade等等）可以对任意指定的核酸序列 (DNA或RNA) 进行切割或编辑。从首次对其功能报道至今不过10年左右，然而因其巨大的应用价值，获得了令人惊讶的速度蓬勃发展，其发现者Jennifer Doudna, Emmanuelle Charpentier已经于2020年分享诺贝尔化学奖。CRISPR-Cas系统的工作分为三步，如下图所示。首先是CRISPR系统整合酶Cas1-Cas2复合物捕捉外源入侵DNA序列（如图中的噬菌体），再将其整合到CRISPR Array当中去，该步骤被称为Adaptation。然后CRISPR Array会被转录为RNA序列（pre-RNA），经过相关的Cas蛋白加工成为较短的、成熟的指引RNA（guide RNA）序列，再与效应器（Cas9, Cas12, Cas12, Cascade等）结合成为具有靶向功能的效应器复合物。最后当存在与guide RNA相同序列的外源性DNA再次入侵时，效应器会立刻启动靶向，从而对入侵物进行切割清除。其中第一步的Cas1-Cas2捕捉和整合外源DNA的Adaptation过程已经有比较多的研究报道。这其中包括中国科学院生物物理所王艳丽研究员实验室2015年发表于Cell的工作报道了Cas1-Cas2如何识别PAM序列。稍后时间Jenifer实验室通过Nature长文也阐述了类似观点。之后于2017年几乎同期发表的Nature和Science分别报道了可爱龙研究组和Jennifer Doudna研究组的Cas1-Cas2-Prespacer-Target DNA复合物结构，至此基本上讲清Cas1-Cas2复合物是如何捕捉外源性的DNA（Prespacer）并如何整合进入CRISPR Array （Target DNA）的分子机制。然而有一个比较关键的问题：Cas1-Cas2整合Prespacer进入CRISPR Array是具有方向性的，比如在Type I系统之中，PAM链一定是滞后整合进入Repeat-Spacer端（如下图所示），然而其具体机制目前不是很明确。2021年9月29日， Nature以长文形式报道了来自美国康奈尔大学可爱龙实验室题为Mechanism for Cas4-assisted directional spacer acquisition in CRISPR-Cas的研究成果。该论文首次阐述了CRISPR-Cas系统中Cas4如何识别PAM并协助Cas1-Cas2捕捉Prespacer，以及如何调控Prespacer进行方向性整合的分子机制。2018年以来陆续有众多研究工作开始报道，Cas4对Prespacer的选择、加工以及方向性整合具有至关重要的作用。不过这些工作基本上都是从体内in vivo的进行的功能阐述，无法解释Cas4这些行为的具体的机制。此外需要注意的是，Cas4首次的单亚基晶体结构报道实际上可追溯到2012年左右，然而这时期的对Cas4功能阐述观点不一，存在很多争议，因此有关Cas4的问题依然是一团疑云。Cas4研究的障碍在于Cas4是一种Fe-S铁硫簇家族核酸酶，其Fe-S对氧气异常敏感从而导致蛋白迅速变性沉淀，此外其底物也不明确，因而体外对其复合物组装工作比较难开展。2019年荷兰Delft University of Technology的Stan J J Brouns团队发现一种高效的来源于Geobacter sulfurreducens的GsCas4-Cas1融合系统，该融合系统的发现可能对Cas4的稳定性提高有一定帮助。基于此背景，可爱龙教授带领其实验室胡纯一博士等人，联合Stan J J Brouns团队，使用GsCas4-Cas1融合系统，在优化了很多纯化条件之后，最终在厌氧条件下获得了性质稳定、均一的Cas4-Cas1蛋白。之后尝试组装Cas4-Cas1-Cas2-Prespacer_Dual PAM复合物，其团队通过筛选底物，获得了高度均一的复合物，并且使用冷冻电镜解析了其3.0埃分辨率的复合物结构。结构首次揭示了在此系统之中是由Cas4识别PAM序列，而非以往报道的由Cas1负责识别PAM（如下图所示）。同时，他们发现新鲜纯化出来的样品展现出的是异常精确的特异性切割——Cas4只会以内切酶形式切割PAM序列，然而当样品经过氧化后，Cas4的Fe-S簇被破坏，Cas4的活性就会杂乱无章，对序列没有特异性，同时会展现出内切酶和外切酶活性。这个结论，解释了以往关于Cas4酶活不同性质的报道，一定程度上解决了这些争议问题。之后团队继续解析了Cas4-Cas1-Cas2-Prespacer_PAM/Non PAM复合物结构。发现如果Prespacer的3' 端不存在PAM序列的话，Cas4会释放该末端，并呈递给宿主细胞的核酸酶。后续的生化试验也证明了核酸酶ExoI能迅速切割Non-PAM末端，而PAM端被Cas4紧紧保护从而无法被切割。这揭示了PAM端滞后整合的分子基础。（如下图所示）不过这些结论只能解释Cas4识别PAM协助Cas1-Cas2捕捉外源DNA的分子机制，无法完全解释方向性整合问题。后来可爱龙团队通过高分辨率结构得知完整的复合物中Cas4虽然结合底物以及金属离子，然后其并未切割PAM而只是识别结合。因此猜测必定还存在某种机制激活Cas4酶活，再对PAM进行切割加工。在此基础之上，团队继续解析了一系列Cas4-Cas1-Cas2-Prespacer-Target DNA半整合以及全整合结构，通过结构和生化分析，揭示了在Non-PAM端被ExoI快速加工后会迅速被整合进入CRISPR Array的Leader-Repeat端，从而形成半整合状态。在此半整合状态下，一段突出的DNA序列会结合Cas4-Cas1蛋白一块正电荷富集区，然后推动Cas4高效切割PAM，切割完成后Cas4会将末端传递给Cas1整合酶活性中心完成全整合过程（如下图所示）。该项研究首次揭示了CRISPR-Cas系统中Cas4通过识别PAM序列协助整合酶Cas1-Cas2捕捉Prespacer的分子机制，此外通过一些结构和生化手段揭示了Cas4介导的Prespacer方向性整合的详细分子机制。最后值得称道的是，可爱龙教授持续深耕于CRISPR-Cas领域，发表于今天的Nature工作是其继2016年Nature报道Type I-E系统Cascade识别PAM机制；2017年7月Cell发表I-E系统Cascade/R-loop分子机制以及同年9月Nature报道II-A系统Cas1-Cas2整合Prespacer进入CRISPR Array的分子机制；2018年Science报道Cascade/R-loop招募Cas3的分子基础；2020年NSMB报道使用单分子手段实时观察Cas1-Cas2整合行为之后，在该领域又一项具有里程碑式意义的研究。来源：微信公众号“细胞”。
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